روشهای خالصسازی پروتئین در بیوتکنولوژی: راهنمای جامع
در تحقیقات بیوتکنولوژی، مهندسی پروتئین نقش کلیدی در طراحی و اصلاح پروتئینها ایفا میکند. تکنیکهای خالصسازی پروتئین، ویژگیهای پروتئینها را برای کاربردهای صنعتی خاص بهینه میکنند.
این تکنیکها به دانشمندان امکان میدهند تا پروتئینهای مورد نظر را جدا و خالص کنند تا بتوانند ساختار سه بعدی (conformational) و ویژگیهای سوبسترایی (substrate specificity) آنها را بررسی نمایند. همچنین، واکنش پروتئینها با سایر لیگاندها (مولکولهایی که به گیرندههای پروتئینی متصل میشوند) و فعالیتهای آنزیمی خاص نیز مورد مطالعه قرار میگیرند.
درجه خلوص مورد نیاز پروتئین، به کاربرد نهایی آن بستگی دارد. در برخی موارد، یک عصاره خام کافی است. اما در کاربردهایی مانند صنایع غذایی و دارویی، سطح بالایی از خلوص مورد نیاز است. برای دستیابی به سطح خلوص مورد نظر، از تکنیکهای مختلف خالصسازی پروتئین استفاده میشود.
تدوین استراتژی خالصسازی پروتئین
هر مرحله از خالصسازی پروتئین معمولاً با مقداری از دست رفتن محصول همراه است. بنابراین، یک استراتژی ایدهآل، دستیابی به بالاترین سطح خلوص در کمترین تعداد مراحل است.
انتخاب مراحل مناسب به اندازه، بار الکتریکی، حلالیت و سایر ویژگیهای پروتئین هدف بستگی دارد. تکنیکهای زیر برای خالصسازی یک پروتئین سیتوزولی منفرد مناسبتر هستند.
خالصسازی کمپلکسهای پروتئینی سیتوزولی پیچیدهتر است و معمولاً نیاز به استفاده از روشهای مختلفی دارد.
تهیه عصاره خام
نخستین گام در خالصسازی پروتئینهای داخل سلولی، تهیه یک عصاره خام است. این عصاره شامل ترکیبی پیچیده از تمامی پروتئینهای سیتوپلاسم سلول، و همچنین برخی از درشتمولکولها، کوفاکتورها و مواد مغذی دیگر خواهد بود.
این عصاره خام ممکن است برای برخی از کاربردها در بیوتکنولوژی مورد استفاده قرار گیرد. با این حال، اگر خلوص اهمیت داشته باشد، باید مراحل خالصسازی بعدی دنبال شوند. عصارههای خام پروتئینی با حذف بقایای سلولی تولیدشده توسط لیز سلولی تهیه میشوند که با استفاده از مواد شیمیایی، آنزیمها، سونیکاسیون یا پرس فرانسوی به دست میآید.
حذف بقایا از عصاره
بقایا با استفاده از سانتریفیوژ حذف میشوند و سپس مایع رویی (مایع بالای رسوب جامد) جمعآوری میگردد. آمادهسازیهای خام پروتئینهای خارج سلولی را میتوان به سادگی با حذف سلولها توسط سانتریفیوژ به دست آورد.
در برخی کاربردهای بیوتکنولوژی، تقاضا برای آنزیمهای مقاوم به حرارت (ترموستابل) وجود دارد؛ آنزیمهایی که میتوانند دماهای بالا را بدون دناتوره شدن تحمل کنند و در عین حال فعالیت اختصاصی بالایی را حفظ نمایند.
موجوداتی که پروتئینهای مقاوم به حرارت تولید میکنند، گاهی اوقات اکسترموفیل نامیده میشوند. یک روش آسان برای خالصسازی یک پروتئین مقاوم به حرارت، دناتوره کردن سایر پروتئینهای موجود در مخلوط با گرم کردن و سپس خنک کردن محلول است (در نتیجه به آنزیم ترموستابل اجازه میدهد در صورت نیاز دوباره تشکیل شود یا دوباره حل شود). پروتئینهای دناتوره شده را میتوان با سانتریفیوژ حذف کرد.
مراحل میانی خالصسازی پروتئین
پروتکلهای مدرن بیوتکنولوژی اغلب از کیتها یا روشهای تجاری متعددی استفاده میکنند که محلولهای آماده برای روشهای استاندارد ارائه میدهند. خالصسازی پروتئین اغلب با استفاده از فیلترها و ستونهای ژل فیلتراسیون آماده انجام میشود.
دستورالعملهای کیت دیالیز را دنبال کنید، حجم مناسبی از محلول مناسب را اضافه کنید و در حالی که الوانت (حلالی که از ستون عبور داده میشود) را در یک لوله آزمایش تازه جمعآوری میکنید، مدت زمان مشخصشده را صبر کنید.
استفاده از روشهای کروماتوگرافی
روشهای کروماتوگرافی را میتوان با استفاده از ستونهای رومیزی یا تجهیزات HPLC خودکار اعمال کرد. جداسازی با HPLC را میتوان با روشهای فاز معکوس، تبادل یونی یا طرد اندازه انجام داد و نمونهها را با آرایه دیودی یا فناوری لیزر شناسایی کرد.
به کارگیری رسوبدهی
در گذشته، یک مرحله دوم رایج برای خالصسازی پروتئین از یک عصاره خام، رسوبدهی در محلولی با قدرت اسمزی بالا (یعنی محلولهای نمکی) بود. رسوبدهی پروتئین معمولاً با استفاده از سولفات آمونیوم به عنوان نمک انجام میشود. اسیدهای نوکلئیک موجود در عصاره خام را میتوان با رسوبدهی تودههایی که با سولفات استرپتومایسین یا سولفات پروتامین تشکیل شدهاند، حذف کرد.
رسوبدهی نمکی معمولاً منجر به یک پروتئین بسیار خالص نمیشود، اما میتواند به حذف برخی از پروتئینهای ناخواسته در یک مخلوط و غلیظ کردن نمونه کمک کند. سپس نمکهای موجود در محلول با دیالیز از طریق لولههای سلولزی متخلخل، فیلتراسیون یا کروماتوگرافی طرد ژلی حذف میشوند.
پروتئینهای مختلف در غلظتهای مختلف سولفات آمونیوم رسوب میکنند. به طور کلی، پروتئینهای با وزن مولکولی بالاتر در غلظتهای پایینتری از سولفات آمونیوم رسوب میکنند.
تصویرسازی پروتئین و ارزیابی خالصسازی
کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC) پروتئینها را بر اساس آبگریزی نسبی آنها (دفع مولکولهای غیرقطبی از آب) جدا میکند. این تکنیک بسیار گزینشی است اما نیاز به استفاده از حلالهای آلی دارد.
برخی از پروتئینها توسط حلالها به طور دائمی دناتوره میشوند و در طی RPC عملکرد خود را از دست میدهند. بنابراین این روش برای همه کاربردها توصیه نمیشود، به ویژه اگر لازم باشد پروتئین هدف فعالیت خود را حفظ کند.
تبادل یونی
کروماتوگرافی تبادل یونی به جداسازی پروتئینها بر اساس بار الکتریکی اشاره دارد. ستونها را میتوان برای تبادل آنیونی یا تبادل کاتیونی آماده کرد. ستونهای تبادل آنیونی حاوی یک فاز ساکن با بار مثبت هستند که پروتئینهای دارای بار منفی را جذب میکند.
تبادل کاتیونی و ژل فیلتراسیون
ستونهای تبادل کاتیونی برعکس هستند، مهرههای با بار منفی که پروتئینهای دارای بار مثبت را جذب میکنند. الوشن (استخراج یک ماده از ماده دیگر) پروتئین(های) هدف با تغییر pH در ستون انجام میشود، که منجر به تغییر یا خنثی شدن گروههای عملکردی باردار هر پروتئین میشود.
کروماتوگرافی طرد اندازه
کروماتوگرافی طرد اندازه (که به عنوان ژل فیلتراسیون نیز شناخته میشود) پروتئینهای بزرگتر را از پروتئینهای کوچکتر جدا میکند، زیرا مولکولهای بزرگتر سریعتر از طریق پلیمر شبکهای در ستون کروماتوگرافی حرکت میکنند. پروتئینهای بزرگ در منافذ پلیمر جای نمیگیرند، در حالی که پروتئینهای کوچکتر این کار را میکنند و از طریق یک مسیر غیر مستقیم، مدت بیشتری طول میکشد تا از ستون کروماتوگرافی عبور کنند.
زمان الوشن
الوات (نتیجه الوشن) در یک سری لولهها جمعآوری میشود که پروتئینها را بر اساس زمان الوشن جدا میکند. ژل فیلتراسیون ابزار مفیدی برای تغلیظ یک نمونه پروتئینی است، زیرا پروتئین هدف در حجم الوشن کمتری نسبت به حجم اولیه اضافه شده به ستون جمعآوری میشود. تکنیکهای فیلتراسیون مشابه ممکن است در تولید پروتئین در مقیاس بزرگ به دلیل مقرون به صرفه بودن آنها استفاده شوند.
کروماتوگرافی افینیتی و الکتروفورز
کروماتوگرافی افینیتی یک تکنیک بسیار مفید برای "صیقل دادن" یا تکمیل فرایند خالصسازی پروتئین است. مهرهها در ستون کروماتوگرافی به لیگاندها متصل میشوند که به طور خاص به پروتئین هدف متصل میشوند.
سپس پروتئین با شستشو با محلولی حاوی لیگاندهای آزاد از ستون جدا میشود. این روش در مقایسه با سایر تکنیکها خالصترین نتایج و بالاترین فعالیت اختصاصی را ارائه میدهد.
SDS-PAGE
SDS-PAGE (سدیم دودسیل سولفات مورد استفاده با الکتروفورز ژل پلیآکریلآمید) به پروتئینها متصل میشود و به آنها بار منفی خالصی زیادی میدهد. از آنجایی که بارهای همه پروتئینها نسبتاً برابر هستند، این روش آنها را تقریباً به طور کامل بر اساس اندازه جدا میکند.
SDS-PAGE اغلب برای آزمایش خلوص پروتئین پس از هر مرحله در یک سری استفاده میشود. با حذف تدریجی پروتئینهای ناخواسته از مخلوط، تعداد باندهای قابل مشاهده روی ژل SDS-PAGE کاهش مییابد، تا زمانی که فقط یک باند نشاندهنده پروتئین مورد نظر وجود داشته باشد.
ایمونوبلاتینگ
ایمونوبلاتینگ یک تکنیک تصویرسازی پروتئین است که در ترکیب با کروماتوگرافی افینیتی استفاده میشود. آنتیبادیهای یک پروتئین خاص به عنوان لیگاند روی یک ستون کروماتوگرافی افینیتی استفاده میشوند.
پروتئین هدف روی ستون نگهداری میشود، سپس با شستشوی ستون با محلول نمکی یا سایر عوامل حذف میشود. آنتیبادیهای متصل به برچسبهای رادیواکتیو یا رنگی به شناسایی پروتئین هدف پس از جدا شدن از بقیه مخلوط کمک میکنند.
- شیمی
- علم
