آموزش جامع ساخت بافر TAE: راهنمای گام به گام و آسان
بافر TAE چیست و چرا به آن نیاز دارید؟
بافر TAE، محلولی است که از ترکیب باز Tris، استیک اسید و EDTA (تریس-استات-EDTA) به دست میآید. در گذشته، این بافر به عنوان رایجترین بافر در الکتروفورز ژل آگارز برای تجزیه و تحلیل محصولات DNA حاصل از تکثیر PCR، پروتکلهای خالصسازی DNA یا آزمایشهای کلونینگ DNA مورد استفاده قرار میگرفت.
این بافر دارای قدرت یونی و ظرفیت بافری پایین است. از این رو، برای الکتروفورز قطعات بزرگ DNA (بزرگتر از 20 کیلوباز) مناسبتر است و نیاز به تعویض مکرر یا بازچرخش برای زمانهای اجرای ژل طولانیتر (بیش از 4 ساعت) دارد. با در نظر گرفتن این موضوع، بهتر است چندین بچ از این بافر را تهیه کنید.
با توجه به سهولت تهیه بافر و سرعت انجام مراحل آن، تهیه بیش از یک بچ به طور همزمان نباید زمانبر یا دشوار باشد. با استفاده از دستورالعملهای زیر، تهیه بافر TAE تنها 30 دقیقه طول میکشد.
مواد و وسایل مورد نیاز برای تهیه بافر TAE
تهیه بافر TAE نیازمند مواد و وسایل زیادی نیست و به راحتی قابل انجام است. برای این کار به موارد زیر نیاز خواهید داشت:
- EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) دی سدیم سالت
- باز Tris
- استیک اسید گلاسیال
- pH متر و محلولهای استاندارد کالیبراسیون pH متر
- بشر یا فلاسکهای 600 میلیلیتری و 1500 میلیلیتری
- استوانه مدرج
- آب دیونیزه
- میلههای همزن
- صفحه همزن
نکته: در دستورالعملهای زیر، وزن فرمولی (مجموع جرم اتمی هر عنصر ضربدر تعداد اتمها) با FW نشان داده میشود.
تهیه محلول استوک EDTA
محلول EDTA را باید از قبل آماده کنید. EDTA تا زمانی که pH به حدود 8.0 نرسد، به طور کامل در محلول حل نمیشود.
برای تهیه 500 میلیلیتر محلول استوک 0.5M EDTA:
- 93.05 گرم EDTA دی سدیم سالت (FW = 372.2) را وزن کنید.
- آن را در 400 میلیلیتر آب دیونیزه حل کنید.
- pH را با استفاده از سدیم هیدروکسید (NaOH) به 8.0 برسانید.
- حجم محلول را با اضافه کردن آب دیونیزه به 500 میلیلیتر برسانید.
تهیه محلول استوک بافر TAE (50X)
برای تهیه محلول استوک غلیظ (50X) بافر TAE، مراحل زیر را دنبال کنید:
- 242 گرم باز Tris (FW = 121.14) را وزن کنید و در تقریباً 750 میلیلیتر آب دیونیزه حل کنید.
- به آرامی 57.1 میلیلیتر استیک اسید گلاسیال و 100 میلیلیتر EDTA 0.5M (pH 8.0) را اضافه کنید.
- حجم محلول را با افزودن آب دیونیزه به 1 لیتر برسانید.
این محلول استوک را میتوان در دمای اتاق نگهداری کرد. pH این بافر تنظیم نمیشود و باید حدود 8.5 باشد.
تهیه محلول کاری بافر TAE (1X)
محلول کاری بافر TAE (1X) را به سادگی با رقیق کردن محلول استوک (50X) به میزان 50 برابر با آب دیونیزه تهیه کنید. غلظت نهایی مواد حل شده 40 میلیمولار Tris-acetate و 1 میلیمولار EDTA خواهد بود. اکنون بافر آماده استفاده در الکتروفورز ژل آگارز است.
نکات پایانی
قبل از شروع کار، مطمئن شوید که تمامی مواد و وسایل مورد نیاز برای تهیه بافر TAE را در اختیار دارید. با مسئول انبار خود چک کنید تا از موجود بودن همه موارد اطمینان حاصل کنید. کمبود وسایل در حین کار میتواند روند تهیه بافر را مختل کند.
- شیمی
- علم
