آموزش قدم به قدم ساخت بافر TBE: راهنمای سریع و آسان
بافر TBE چیست و چه کاربردی دارد؟
بافر TBE (تریس-بورات-EDTA) یک محلول بافری است که از ترکیب تریس باز، بوریک اسید و EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) تشکیل شده است. این بافر به طور گسترده در الکتروفورز ژل آگارز برای تجزیه و تحلیل محصولات DNA حاصل از تکثیر PCR، پروتکلهای خالصسازی DNA و یا آزمایشهای کلونینگ DNA مورد استفاده قرار میگیرد.
کاربردهای بافر TBE
بافر TBE به ویژه برای جداسازی قطعات کوچک DNA (با وزن مولکولی کمتر از 1000 باز) مانند محصولات کوچک حاصل از هضم آنزیمهای محدود کننده بسیار مفید است. بافر TBE ظرفیت بافری بالاتری دارد و در مقایسه با بافر TAE (تریس-استات-EDTA) تفکیک بهتری ارائه میدهد. با این حال، TBE معمولاً گرانتر از TAE است و فعالیت DNA لیگاز را مهار میکند، که ممکن است در مراحل بعدی خالصسازی و اتصال DNA مشکلاتی ایجاد کند.
در ادامه، با سه مرحله ساده نحوه ساخت بافر TBE را خواهید آموخت. این فرآیند نباید بیش از 30 دقیقه طول بکشد.
مواد و تجهیزات مورد نیاز
برای تهیه بافر TBE، به چهار ماده اصلی نیاز دارید: نمک دیسدیم EDTA، تریس باز، بوریک اسید و آب دیونیزه.
علاوه بر این مواد، به تجهیزات زیر نیز نیاز خواهید داشت:
- pH متر و محلولهای استاندارد کالیبراسیون
- بشر یا ارلن با حجمهای 600 میلیلیتر و 1500 میلیلیتر
- استوانه مدرج
- مگنت و همزن مغناطیسی
قبل از شروع کار، حتماً موجودی مواد و تجهیزات آزمایشگاه خود را بررسی کنید. تمام شدن مواد در حین آمادهسازی محلول میتواند بسیار ناخوشایند باشد. همچنین، در صورت استفاده از آزمایشگاه مدرسه یا محل کار، با مسئول مربوطه هماهنگ کنید تا از موجود بودن مواد اطمینان حاصل کنید. این کار در نهایت در وقت و انرژی شما صرفهجویی خواهد کرد.
نکته: وزن فرمولی (FW) مخفف Formula Weight است و برابر است با مجموع حاصل ضرب وزن اتمی هر عنصر در تعداد اتمهای آن عنصر در یک فرمول شیمیایی.
تهیه محلول استوک EDTA
محلول EDTA را باید از قبل تهیه کنید. EDTA تا زمانی که pH آن به حدود 8.0 نرسد، به طور کامل در آب حل نمیشود. برای تهیه 500 میلیلیتر محلول استوک 0.5M EDTA، مراحل زیر را دنبال کنید:
- 93.05 گرم نمک دیسدیم EDTA (FW = 372.2) را وزن کنید.
- آن را در 400 میلیلیتر آب دیونیزه حل کنید.
- pH محلول را با استفاده از NaOH (سدیم هیدروکسید) تا حدود 8.0 تنظیم کنید.
- حجم نهایی محلول را با افزودن آب دیونیزه به 500 میلیلیتر برسانید.
تهیه محلول استوک TBE (غلظت 5X)
برای تهیه محلول استوک TBE با غلظت 5 برابر، مراحل زیر را دنبال کنید:
- 54 گرم تریس باز (FW = 121.14) و 27.5 گرم بوریک اسید (FW = 61.83) را وزن کنید.
- هر دو ماده را در حدود 900 میلیلیتر آب دیونیزه حل کنید.
- 20 میلیلیتر محلول EDTA 0.5M (با pH 8.0) را به آن اضافه کنید.
- حجم نهایی محلول را با افزودن آب دیونیزه به 1 لیتر برسانید.
این محلول را میتوان در دمای اتاق نگهداری کرد، اما ممکن است در محلولهای قدیمی رسوب تشکیل شود. بافر را در بطریهای شیشهای نگهداری کنید و در صورت تشکیل رسوب، آن را دور بریزید.
تهیه محلول کار TBE
برای الکتروفورز ژل آگارز، معمولاً از بافر TBE با غلظت 0.5X (رقیقسازی 1:10 از محلول استوک غلیظ شده) استفاده میشود. برای تهیه این محلول، محلول استوک را 10 برابر با آب دیونیزه رقیق کنید. غلظت نهایی مواد حل شده، 45 میلیمولار تریس-بورات و 1 میلیمولار EDTA خواهد بود. اکنون بافر برای استفاده در الکتروفورز ژل آگارز آماده است.
- شیمی
- علم
